「ＡＤＰーＧｌｏ」: 「ホタルの光」 (蛍光) を駆使した (最新の) キナーゼ活性の定量法

最近、キナーゼ活性を測定 (定量) するのに、従来の「放射性アイソトープ」の代わりに「ホタルの光 」(蛍光) を利用した「ＡＤＰーＧｌｏ」と呼ばれるキナーゼ定量セット (Promega から発売) が研究室で流行している。 その原理をごく簡単に解説すると、次のようになる。

キナーゼにより蛋白が燐酸化されると、基質のＡＴＰが分解されて、ＡＤＰになる。この蛍光法は、生成したＡＤＰの量を定量する。 特殊な試薬で、まず残ったＡＴＰを除いた後、ＡＤＰを燐酸化してＡＴＰの形に戻し、ホタル由来の蛍光源「ルシフェリン」と酵素「ルシフェラーゼ」を利用して、蛍光を発する仕組みである。 この蛍光反応はＡＴＰの量に正比例する。

逆に、この蛍光定量法に多少の改良を加えて、ＰＡＫなどの"発癌キナーゼ" を阻害する化合物 (あるいはその阻害活性を強化する新規な酵素、例えば「ＳＴＯＨａｓｅ」など) のスクリーニングや単離精製などが簡便になし得る。

勿論、この方法は「キナーゼ活性」ばかりではなく、ＡＴＰを分解するミオシンやＨＳＰ (熱ショック蛋白) などの「ＡＴＰａｓｅ活性」の測定にも利用できる。

詳しくは、下記のインターネット欄を参照されたし:

 http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=2102001

この蛍光定量法は元来、２００８年頃、中国の蘇州（上海の近郊) の「Ｇｅｎｅｗｉｚ」の研究者によって発明されたもので、その特許を米国のバイオテック会社「Promega」が買い取り、製品化したものである。　
http://www.google.com.ar/patents/US8420341

ＰＣＲやＧＦＰとほぼ同等の極めて有用な生化学的技術の発明であり、ノーベル賞はともかく、(将来) 少なくとも「ラスカー医学賞」あるいは「京都賞」(稲盛財団) には価いすると私は思う。
「日中友好」推進という観点からも、特にこの中国人発明家を「京都賞」候補として率先して推薦したい。

参考文献:

Zegzouti H, Zdanovskaia M, Hsiao K, Goueli SA.

ADP-Glo: A Bioluminescent and homogeneous ADP monitoring assay for kinases.

Assay Drug Dev Technol. 2009 ; 7:560-72.

Li H, Totoritis RD, Lor LA, Schwartz B, et al. 
Evaluation of an antibody-free ADP detection assay: ADP-Glo.  
Assay Drug Dev Technol. 2009 ;7 :598-605.

 

「ＳＴＯＨａｓｅ」（ＳＴの３位を水酸化する酵素）: 活性の定量法と酵素の精製法

ブラジル沿岸に生息する特殊な海鞘に存在するはず (あるいは屠殺した牛などの脳組織にも存在するかもしれない) 「ＳＴＯＨａｓｅ」（ＳＴの３位を水酸化する=ＳＴー２００１合成酵素）の活性を如何にして簡便に定量し、さらに如何に酵素を単離精製するか、その方法を先ず開発することが、このプロジェクトの成功への決め手 (鍵) となる。

定量法:  ＳＴの水酸化により合成される「ＳＴー２００１」の量を（間接的に）ＰＡＫ１阻害活性で定量する。１０年以上昔に我々が得た研究結果によれば、ＳＴのＣＤ５０は５０　ｎＭ、「ＳＴー２００１」のＣＤ５０は１　ｎＭ である。 言いかえれば、「ＳＴー２００１」が生成されると、ＰＡＫ１阻害活性が最大５０倍までに上昇する。生化学の常識に従えば、この水酸化反応には 酵素以外に、空中の酸素、鉄イオンおよびＢＨ４ (Tetrahydrobiopterin) が補酵素として必須であると推定される。

精製法:  水酸化反応に補酵素「ＢＨ４」が必須であることが予測通り証明/確認されれば、「ＢＨ４」Ｓｅｐａｈｒｏｓｅ などを使用して「ａｆｆｉｎｉｔｙ」精製することができるだろう。さらに、この酵素が「トリプトファン水酸化酵素」のごとく、カルモジュリン依存キナーゼにより燐酸化されるならば、ＡＴＰーａｇａｒｏｓｅやカルモジュリンＳｅｐｈａｒｏｓｅなども駆使して「ａｆｆｉｎｉｔｙ」精製が可能であろう。

さて、特に「トリプトファン水酸化酵素」に我々が何故こだわるかと言えば、実はＳＴは生合成の過程で、まず（アミノ酸の一種）トリプトファン２分子が重合して「インドールカルバゾール環」を形成後、単糖（ヘキソース）が結合し、更に様々な化学修飾を経たのち、最終段階で水酸化されると推定されるからである。脳内でトリプトファンは５位が水酸化されて、最終的には「セロトニン」という神経ホルモンに変化することが知られている。この位置は丁度ＳＴの３位に相当する。従って、海鞘では同じ酵素がＳＴの水酸化にも関与している可能性が考えられる。