“マカロニ西部劇・沖縄流” (非放射性) “キナーゼ” 定量法 ：免疫沈降法（IP） plus ATP-Glo kinase assay

最近、沖縄の琉球大学構内に新設したPAK総合研究所で、留学院生と共に、（放射性アイソトープを使用しない）免疫沈降法（IP） を利用した簡便な新しいPAK定量法 ”沖縄流” を開発したが、良く文献を調べてみると、なんと１０年前に、イタリアの研究グループが、別のキナーゼ（CDK） をモデルにして、良く似たキナーゼ定量法をすでに開発していたことが判明、我々のIdea　(沖縄流)　は独自だったが、生憎１０年遅れに終わった！　そこで、このユニークな定量法［マカロニ西部劇 (Macaroni-Western)・沖縄流］を以下“英語”で簡単に紹介しよう。　この方法を使えば、健康長寿に役立つ各種のPAK遮断剤を細胞培養系で敏速にスクリーニングしうる。　なお、数年前に我々は線虫（HSP１６-GFPを発現するCL2070株など）を実験動物として使用して、PAK遮断剤を安価かつ敏速にスクリーニングする方法も開発している。

従来は、非放射性PAK活性定量法として、pPAK免疫ブロット (Western Blot) 法というのが使用されていた。この方法は、細胞中でPAKが活性化されると、ある特定のセリンあるいはスレオニンがリン酸化されるという現象を利用したもので、例えば、スレオニン４２３が自己リン酸化されたｐPAKに対する抗体で、PAK活性を定量する。しかしながら、我々は、PAKが活性化されても、pPAKが全く上昇しない例を、しばしば観察している.　一例をあげれば、メラニン色素の合成を刺激するホルモンは、細胞内でPAKを活性化するが、pPAKの上昇は全く見られない。　従って、“沖縄流” で細胞中のPAK活性を直接定量する必要がある。


 Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Utilization of luminescent technology to develop a kinase assay: Cdk4 as a model system.　J Pharm Biomed Anal. 2005;　39: 811-4.

要旨

Here, a simple, effective, “non radioactive” method to measure kinase activity of immunoprecipitated proteins is described. Cdk4, a cell cycle dependent enzyme, was immunoprecipitated （IP）  from whole cell extracts and used in kinase reactions. This system has been developed taking advantage of the kinase-Glo reagent (Promega), based on ATP depletion technology, but with a wider range of applications. The original aim of the commercial luciferase kit is the evaluation of kinase activity of highly purified enzymes, while this system enabled the evaluation of native kinases, retrieved by IP。 It is suitable for monitoring the changes in a given kinase activity in cells (independent of auto-phosphorylation sites), and useful for a quick screening for "highly cell-permeable" and  "specific" kinase inhibitors from chemical libraries or herbal extracts.