「ＡＤＰーＧｌｏ」: 「ホタルの光」 (蛍光) を駆使した (最新の) キナーゼ活性の定量法

最近、キナーゼ活性を測定 (定量) するのに、従来の「放射性アイソトープ」の代わりに「ホタルの光 」(蛍光) を利用した「ＡＤＰーＧｌｏ」と呼ばれるキナーゼ定量セット (Promega から発売) が研究室で流行している。 その原理をごく簡単に解説すると、次のようになる。

キナーゼにより蛋白が燐酸化されると、基質のＡＴＰが分解されて、ＡＤＰになる。この蛍光法は、生成したＡＤＰの量を定量する。 特殊な試薬で、まず残ったＡＴＰを除いた後、ＡＤＰを燐酸化してＡＴＰの形に戻し、ホタル由来の蛍光源「ルシフェリン」と酵素「ルシフェラーゼ」を利用して、蛍光を発する仕組みである。 この蛍光反応はＡＴＰの量に正比例する。

逆に、この蛍光定量法に多少の改良を加えて、ＰＡＫなどの"発癌キナーゼ" を阻害する化合物 (あるいはその阻害活性を強化する新規な酵素、例えば「ＳＴＯＨａｓｅ」など) のスクリーニングや単離精製などが簡便になし得る。

勿論、この方法は「キナーゼ活性」ばかりではなく、ＡＴＰを分解するミオシンやＨＳＰ (熱ショック蛋白) などの「ＡＴＰａｓｅ活性」の測定にも利用できる。

詳しくは、下記のインターネット欄を参照されたし:

 http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=2102001

この蛍光定量法は元来、２００８年頃、中国の蘇州（上海の近郊) の「Ｇｅｎｅｗｉｚ」の研究者によって発明されたもので、その特許を米国のバイオテック会社「Promega」が買い取り、製品化したものである。　
http://www.google.com.ar/patents/US8420341

ＰＣＲやＧＦＰとほぼ同等の極めて有用な生化学的技術の発明であり、ノーベル賞はともかく、(将来) 少なくとも「ラスカー医学賞」あるいは「京都賞」(稲盛財団) には価いすると私は思う。
「日中友好」推進という観点からも、特にこの中国人発明家を「京都賞」候補として率先して推薦したい。

参考文献:

Zegzouti H, Zdanovskaia M, Hsiao K, Goueli SA.

ADP-Glo: A Bioluminescent and homogeneous ADP monitoring assay for kinases.

Assay Drug Dev Technol. 2009 ; 7:560-72.

Li H, Totoritis RD, Lor LA, Schwartz B, et al. 
Evaluation of an antibody-free ADP detection assay: ADP-Glo.  
Assay Drug Dev Technol. 2009 ;7 :598-605.

 

「ＳＴＯＨａｓｅ」（ＳＴの３位を水酸化する酵素）: 活性の定量法と酵素の精製法

ブラジル沿岸に生息する特殊な海鞘に存在するはず (あるいは屠殺した牛などの脳組織にも存在するかもしれない) 「ＳＴＯＨａｓｅ」（ＳＴの３位を水酸化する=ＳＴー２００１合成酵素）の活性を如何にして簡便に定量し、さらに如何に酵素を単離精製するか、その方法を先ず開発することが、このプロジェクトの成功への決め手 (鍵) となる。

定量法:  ＳＴの水酸化により合成される「ＳＴー２００１」の量を（間接的に）ＰＡＫ１阻害活性で定量する。１０年以上昔に我々が得た研究結果によれば、ＳＴのＣＤ５０は５０　ｎＭ、「ＳＴー２００１」のＣＤ５０は１　ｎＭ である。 言いかえれば、「ＳＴー２００１」が生成されると、ＰＡＫ１阻害活性が最大５０倍までに上昇する。生化学の常識に従えば、この水酸化反応には 酵素以外に、空中の酸素、鉄イオンおよびＢＨ４ (Tetrahydrobiopterin) が補酵素として必須であると推定される。

精製法:  水酸化反応に補酵素「ＢＨ４」が必須であることが予測通り証明/確認されれば、「ＢＨ４」Ｓｅｐａｈｒｏｓｅ などを使用して「ａｆｆｉｎｉｔｙ」精製することができるだろう。さらに、この酵素が「トリプトファン水酸化酵素」のごとく、カルモジュリン依存キナーゼにより燐酸化されるならば、ＡＴＰーａｇａｒｏｓｅやカルモジュリンＳｅｐｈａｒｏｓｅなども駆使して「ａｆｆｉｎｉｔｙ」精製が可能であろう。

さて、特に「トリプトファン水酸化酵素」に我々が何故こだわるかと言えば、実はＳＴは生合成の過程で、まず（アミノ酸の一種）トリプトファン２分子が重合して「インドールカルバゾール環」を形成後、単糖（ヘキソース）が結合し、更に様々な化学修飾を経たのち、最終段階で水酸化されると推定されるからである。脳内でトリプトファンは５位が水酸化されて、最終的には「セロトニン」という神経ホルモンに変化することが知られている。この位置は丁度ＳＴの３位に相当する。従って、海鞘では同じ酵素がＳＴの水酸化にも関与している可能性が考えられる。

ＰＡＫ阻害剤 （３位が水酸化されたＳＴ誘導体）を産生する 「幻」 の海鞘 (ホヤ) を追って: グアム島から熱帯のブラジル沿岸へ！

１２、３年昔、私はグアム島の海洋研究所にいたドイツ人の有機化学者（Peter Schupp)と一緒に、ある海鞘から採集されたスタロスポーリン（ＳＴ）のユニークな誘導体について共同研究していた。この誘導体 (ＳＴー２００１）はインドールカルバゾール環の３位に水酸基が付いているために、ＳＴよりずっと強い抗癌作用を示す（ＩＣ５０＝１　ｎＭ）。しかし、残念なことには、この誘導体はＰＡＫばかりではなくＰＫＣに対しても強い阻害作用を示し、正常な細胞にも毒性を示すため、臨床にはとても使用できない。

ところが、ＳＴに似た抗生物質で 「Ｋー２５２ａ」に関する研究から、９位にかさばる側鎖を付けると、ＰＫＣに対する阻害活性を選択的に抑えることがわかっていた。そこで、ＳＴー２００１の９位に hexylamine などを付加して、水溶性のＰＡＫ特異的な阻害剤  「ＳＴー３００９」を開発する計画を立てていた。 ところが、いざ実験を開始しようとした矢先、その海鞘がグアム島の沿岸から忽然と姿を消してしまったため、十分な量のＳＴー２００１が得られなくなり、実験中止に追いこまれてしまった！ 

さて、それから数年以上月日が経った最近、偶然にも大変面白い論文を見つけた。何んと、ブラジル海岸に同じような海鞘が生息していることが判明した (「地球温暖化/海水の酸性化」により、海鞘が太平洋から大西洋に "大移動" したのかもしれない)。放線菌由来のＳＴ誘導体で、７位に水酸基が付加した化合物 （ＵＣＮー０１）が PDK1/PKC の阻害剤として （１９８７年以来、協和発酵などにより) 開発されつつあるが、その３位に水酸基が付いた 「ＳＴー３００７」 を産生する海鞘がブラジルの北部沿岸で見つけられた。ブラジルのシエラ大学海洋研究所の科学者による発見である。この海洋誘導体は、癌細胞の増殖をＳＴより数倍強く抑え (IC50= 10 nM) 、更に正常な細胞には比較的に弱い毒性しかを示さない。

従って、この「ＳＴー３００７」がなおＰＡＫを阻害するなら、９位に hexylamine を付加して、選択的にＰＫＣ阻害作用を弱めれば、将来 (副作用のない) 抗癌剤として臨床に応用しうる可能性がまだある。 そこで、このブラジルの研究者に早速メールでコンタクトをとり、共同研究を申し出た。 おかげで、前途が少しバラ色になってきた！

 実は、ＳＴの３位のみに化学的方法で水酸化することは不可能ではないが、収率がひどく悪く経済的に採算がとれないと言われている。そこで、"酵素的に" ３位を選択的に水酸化せざるを得ない。その"酵素" （ＳＴ水酸化酵素, STOHase）をこの特殊な海鞘（あるいは、この海洋生物に寄生した微生物）から単離精製するのが、我々に課せられた今後最も重要な課題である。言い換えれば、前途は多少バラ色になったが、なお多難でもある。